ابزار دقیق مورد استفاده در سیستم های کروماتوگرافی

تجهیزات آزمایشگاهی کروماتوگرافی، اگرچه از نظر عملکرد مشابه هستند، اما می‌توانند در تجهیزات استاندارد خود تغییرات مهمی داشته باشند که بهترین استفاده از آنها را تعیین می‌کند.

اطلاعات زیر مروری بر ابزار دقیق درگیر در تجهیزات کروماتوگرافی مایع کم فشار (LPLC)، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و کروماتوگرافی گازی (GC) ارائه می‌کند.

سیستم کروماتوگرافی مایع کم فشار (LPLC)

سیستم های LPLC مدرن از یک ستون، انژکتور، پمپ فشار کم، آشکارساز و اغلب یک کلکتور کسری تشکیل شده اند. فاز متحرک با عمل پمپ به داخل سیستم کروماتوگرافی کشیده می شود

. از آنجا به انژکتور می رود که در آنجا نمونه مورد آزمایش اضافه می شود. انژکتور همچنین ممکن است به عنوان یک کنترل کننده عمل کند و بین بسیاری از فازهای متحرک متصل در سراسر سنجش جابجا شود

. پس از انژکتور، نمونه به ستونی منتقل می شود که در آن جداسازی اتفاق می افتد. از ستون، آنالیت به یک آشکارساز عبور می کند. آشکارساز پساب را تجزیه و تحلیل می کند تا گونه های شیمیایی مختلف را شناسایی کند و در نتیجه داده تولید کند.

از آشکارساز، فاز متحرک به داخل مخزن زباله پمپ می شود یا برای مطالعه بیشتر جمع آوری می شود. (دستگاهی که مایع شوینده را از ستون جمع آوری می کند، جمع کننده کسری نامیده می شود و نمونه های جمع آوری شده را بر اساس زمان شستشو سازماندهی می کند.

معمولاً هنگام انجام سنجش LPLC از پمپ پریستالتیک استفاده می شود. پمپ های پریستالتیک از یک روتور برای فشار دادن لوله ها و ایجاد خلاء استفاده می کنند.

خلاء مایع را از منبع معرف می کشد و غلتک ها معرف را در طول مسیر لوله حرکت می دهند. معرف فقط لوله را لمس می کند. غلتک ها سیال را با فرو ریختن لوله از سطح بیرونی و فشار دادن سیال جمع شده بین غلتک های مجاور روی سر غلتک و دور از پمپ حرکت می دهند.

پس از تکمیل آزمایش، لوله را می توان جدا کرد و تمیز کرد یا جایگزین کرد. لوله در فرمولاسیون های زیادی برای دستیابی به تعادل مناسب بین سازگاری شیمیایی، اندازه لوله، دمای کار، فشار و طول عمر لوله موجود است.

مزیت اصلی پمپاژ پریستالتیک برای کاربردهای کروماتوگرافی، توانایی ایجاد یک سیستم کاملاً مستقل است که امکان تغییر و نگهداری آسان را فراهم می کند.

ستون مورد استفاده برای LPLC می تواند یک ظرف شیشه ای خالی یا بسته بندی شده باشد. فاز ثابت یک سنجش LPLC یا جامد یا جامد است که با مایع پوشانده شده است. ساختار فیزیکی ستون تا حدی بر جداسازی قابل تشخیص داده‌های پایانی که به عنوان وضوح شناخته می‌شود، تأثیر می‌گذارد.

فاز ثابت در یک ستون بر اساس نوع جدایی که باید رخ دهد تعیین می شود. هنگامی که با فاز متحرک صحیح جفت شوند، آنالیت ها ممکن است در امتداد خطوط قطبیت، میل ترکیبی، کایرالیته، اندازه و بار جدا شوند.

سنجش‌های بیولوژیکی اغلب از ستون‌های میل ترکیبی استفاده می‌کنند که از اتصال ترجیحی پروتئین‌های فعال یا اسیدهای آمینه برای جداسازی اجزای بیولوژیکی از مخلوط استفاده می‌کنند.

این ستون ها ممکن است با محیط جامد که برای یک کاربرد بدون پوشش یا از قبل تصفیه شده باشد، بسته بندی شوند. ستون‌های کروماتوگرافی میل ترکیبی یون فلزی بی‌حرکت (IMAC) یک انتخاب متداول هنگام ایجاد یک سنجش میل ترکیبی هستند.

میل ترکیبی پروتئین A از یک فاز ثابت پوشیده شده در یک پروتئین باکتریایی استفاده می کند که با ایمونوگلوبولین A پیوند می خورد و اجازه می دهد تا از طریق LPLC خالص شود.

ستون‌های نمک‌زدایی برای جدا کردن ماکرومولکول‌ها از مولکول‌های کوچک‌تر در همان مخلوط استفاده می‌شوند، مانند زمانی که نمک‌ها را از مخلوط پروتئین یا فنل از آماده‌سازی‌های اسید نوکلئیک جدا می‌کنند.

لوازم جانبی LPLC

به دلیل نیاز به انتقال فاز متحرک در طول فرآیند، LPLC اغلب به اتصالات لوله، آداپتورها و سایر لوازم جانبی مختلف نیاز دارد. هنگام انتخاب اجزای یک سیستم، سازگاری شیمیایی اجزا باید در نظر گرفته شود.

اگر در شرایط بهداشتی کار می کنید، باید از قطعاتی که به طور خاص برای آن شرایط تعیین شده اند استفاده شود. فیلترهای سرنگ و فیلترهای غشایی نیز برای اطمینان از اینکه فاز متحرک بدون آلودگی باقی می‌ماند و در پایان فرآیند قرائت‌های نادرست ایجاد نمی‌کند، مهم هستند.

به طور کلی، یک فیلتر حلال هنگام خروج فاز متحرک از ذخیره سازی و دیگری قبل از تزریق نمونه قرار می گیرد. ستون های شیشه ای همچنین به حلقه های O-Ring و فریت های مناسب نیاز دارند که باید با استفاده منظم تعویض شوند.

سیستم های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

در حالی که LPLC با اجزای مدولار مشخص می‌شود، اکثر سیستم‌های HPLC معمولاً توسط یک سازنده ساخته می‌شوند، اما همچنان به اجزای جداگانه تقسیم می‌شوند: معرف(ها)، پمپ، انژکتور، ستون و آشکارساز، که همگی توسط لوله به هم متصل می‌شوند.

قطعات یک سیستم HPLC که به طور مرتب تعویض یا تعویض می شوند، ستون ها، فیلترها و سایر لوازم جانبی هستند که با استفاده منظم فرسوده می شوند. سایر تعمیرات گسترده تر معمولاً توسط سازنده سیستم یا توسط یک تکنسین آموزش دیده انجام می شود.

ستون HPLC

ستون های HPLC معمولاً 25 سانتی متر طول و لوله های فولادی ضد زنگ با قطرهای داخلی مختلف هستند که رایج ترین آنها 4.6 میلی متر است.

با این حال، واریانس قابل توجهی از ابعاد معمولی اغلب وجود دارد. ستون‌های موجود برای HPLC با دانه‌های سیلیکا با ترکیبات شیمیایی سطحی مختلف بسته‌بندی شده‌اند که امکان تأثیرات ظریف اما مفید بر جداسازی را فراهم می‌کند.

انتخاب ستون اغلب بر اساس شیمی آنالیت و همچنین معرف‌های فاز متحرک ترجیحی است که ترکیب می‌شوند تا حفظ و انتخاب اختیاری را فراهم کنند.

روش های جداسازی

کروماتوگرافی یک تکنیک بیوفیزیکی مهم است که جداسازی، شناسایی و خالص سازی اجزای یک مخلوط را برای تجزیه و تحلیل کمی و کیفی ممکن می سازد.

پروتئین ها را می توان بر اساس ویژگی هایی مانند اندازه و شکل، بار کل، گروه های آبگریز موجود در سطح و ظرفیت اتصال با فاز ساکن خالص کرد.

چهار تکنیک جداسازی بر اساس ویژگی‌های مولکولی و نوع برهمکنش از مکانیسم‌های تبادل یونی، جذب سطحی، تقسیم‌بندی و حذف اندازه استفاده می‌کنند.

سایر تکنیک های کروماتوگرافی بر اساس بستر ثابت هستند، از جمله ستون، لایه نازک و کروماتوگرافی کاغذی. کروماتوگرافی ستونی یکی از رایج ترین روش های خالص سازی پروتئین است.

کروماتوگرافی بر این اصل استوار است که مولکول‌های مخلوط روی سطح یا جامد اعمال می‌شوند و فاز ساکن سیال (فاز پایدار) در حین حرکت با کمک فاز متحرک از یکدیگر جدا می‌شوند.

عوامل موثر بر این فرآیند جداسازی شامل ویژگی‌های مولکولی مربوط به جذب (مایع-جامد)، تقسیم (مایع-جامد) و میل ترکیبی یا تفاوت بین وزن‌های مولکولی آنها است .

به دلیل این تفاوت ها، برخی از اجزای مخلوط در فاز ساکن مدت بیشتری می مانند و در سیستم کروماتوگرافی به آرامی حرکت می کنند، در حالی که برخی دیگر به سرعت وارد فاز متحرک می شوند و سریعتر از سیستم خارج می شوند.

بر اساس این رویکرد سه جزء اساس تکنیک کروماتوگرافی را تشکیل می دهند.

فاز ثابت : این فاز همیشه از یک فاز “جامد” یا “لایه ای از مایع جذب شده روی سطح یک تکیه گاه جامد” تشکیل شده است.

فاز متحرک: این فاز همیشه از “مایع” یا “جزئی گازی” تشکیل شده است.

مولکول های جدا شده

نوع برهمکنش بین فاز ساکن، فاز متحرک و مواد موجود در مخلوط جزء اساسی موثر در جداسازی مولکول ها از یکدیگر است. روش های کروماتوگرافی مبتنی بر تقسیم در جداسازی و شناسایی مولکول های کوچک به عنوان اسیدهای آمینه، کربوهیدرات ها و اسیدهای چرب بسیار موثر است.

با این حال، کروماتوگرافی میل ترکیبی (یعنی کروماتوگرافی تبادل یونی) در جداسازی ماکرومولکول ها به عنوان اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها موثرتر هستند.

کروماتوگرافی کاغذی در جداسازی پروتئین ها و در مطالعات مربوط به سنتز پروتئین استفاده می شود. کروماتوگرافی گازی مایع در جداسازی الکل، استر، لیپید و گروه های آمینه و مشاهده برهمکنش های آنزیمی استفاده می شود، در حالی که کروماتوگرافی غربال مولکولی به ویژه برای تعیین وزن مولکولی پروتئین ها استفاده می شود. کروماتوگرافی ژل آگارز برای خالص سازی RNA، ذرات DNA و ویروس ها استفاده می شود.

فاز ثابت در کروماتوگرافی، یک فاز جامد یا یک فاز مایع است که روی سطح یک فاز جامد پوشش داده شده است. فاز متحرک که بر روی فاز ساکن جریان دارد، فازی گازی یا مایع است.

اگر فاز متحرک مایع باشد، کروماتوگرافی مایع (LC) و اگر گاز باشد، کروماتوگرافی گازی (GC) نامیده می شود. کروماتوگرافی گازی برای گازها و مخلوط مایعات فرار و مواد جامد استفاده می شود. کروماتوگرافی مایع به ویژه برای نمونه های ناپایدار حرارتی و غیر فرار استفاده می شود.

در HPLC، دو حالت محبوب جداسازی فاز نرمال و فاز معکوس هستند. در یک سنجش فاز عادی، فاز ثابت قطبی تر از فاز متحرک شروع می شود.

این به این معنی است که فاز ثابت از سیلیس اصلاح نشده تشکیل شده است که به طور طبیعی در معرض آب سیلانول قطبی و اسیدی پوشیده شده است.

برای اجرای یک روش کروماتوگرافی فاز معکوس، سطح سیلیکا توسط یک ترکیب غیرقطبی مانند octadecylsilane (ODS) – که در غیر این صورت به عنوان C18 نامیده می شود، پوشش داده می شود.

انتخاب کایرال زمانی اتفاق می‌افتد که یک مخلوط راسمیک به یک ستون پوشیده شده در ترکیبی وارد می‌شود که با هر انانتیومر با درجه ترجیح متفاوتی برهم‌کنش می‌کند.

مولکول متصل به فاز ساکن اغلب خود یک مولکول کایرال است، اما بدون وجود جفت ساختاری آن. به همین دلیل، مولکول متصل می‌تواند با یکی از انانتیومرهای آنالیت هدف، یک کمپلکس گنجاندن تشکیل دهد و آن را حفظ کند.

انانتیومر دیگر در فاز متحرک باقی می ماند و ابتدا شسته می شود. انتخاب فاز ثابت کایرال به درک ساختار آنالیت و همچنین توانایی پیش‌بینی برهمکنش آن با مولکول محدود فاز ثابت بستگی دارد.

برای جداسازی بار یونی در کروماتوگرافی تبادل یونی، ستون های از پیش بسته بندی شده معمولا از دو رزین استفاده می کنند. ستون های انتخاب آنیونی از DEAE-C یا دی اتیل آمینو اتیل سلولز (یک رزین با بار مثبت) تشکیل شده اند.

این رزین دارای یک بار مثبت واحد است و برای آنیون‌ها جذابیت ایجاد می‌کند که هم قوی هستند و هم می‌توانند از رقابت خارج شوند.

ستون‌های انتخاب کاتیونی یک گروه عاملی Q متصل به سلولز یا سفاروز را در خود نگه می‌دارند. گروه Q یک گروه آمینه چهارتایی است که دارای بار منفی است.

ستون‌های حذف اندازه با دانه‌های سیلیکا زیادی بسته‌بندی شده‌اند که موانعی را برای آنالیت حمل شده توسط فاز متحرک ایجاد می‌کنند.

آنها دهانه های کمی برای عبور مولکول های بزرگ باقی می گذارند، به این معنی که مسیرهای کمتری را طی می کنند و ابتدا پس از یک سفر کوتاه تر در ستون، شسته می شوند.

مولکول‌های کوچک گزینه‌های بیشتری دارند و هنگام حرکت در ستون مسیرهای بیشتری را طی می‌کنند و باعث می‌شوند بعداً شسته شوند.

لوازم جانبی HPLC

سیستم های HPLC برای حفظ نظم کاری خود به قطعات مصرفی متکی هستند. مهر و موم دریچه ها، فریت ها، سوزن های تزریق و پیستون های مورد استفاده در فرآیند کروماتوگرافی در نهایت نیاز به تعویض خواهند داشت.

HPLC همچنین به یک رسانه فاز متحرک خالص نیاز دارد، یا ممکن است آسیب به ستون و آشکارساز آن رخ دهد. برای کمک به حفظ خلوص فاز متحرک، استفاده از فیلترهای حلال ورودی مناسب، درب بطری و سایر لوازم جانبی HPLC مفید است.

سیستم کروماتوگرافی گازی (GC)

یک سیستم GC معمولا توسط یک سازنده ساخته می شود. با این حال، هر سیستم اجزای مشابهی دارد. منبع گازی وجود دارد که فاز متحرک از آنجا سرچشمه می گیرد.

این منبع ممکن است یک مخزن یکبار مصرف یا یک ظرف پر شده توسط یک ژنراتور گاز باشد. فاز متحرک منبع را ترک می کند تا در حالی که تحت فشار است به ستون GC منتقل شود.

خود ستون در داخل یک محفظه داخلی یا اجاق دستگاه کروماتوگرافی قرار می گیرد که در طی فرآیند تحلیلی گرم می شود. نمونه‌ها توسط یک انژکتور به GC معرفی می‌شوند، که اغلب خودکار است، بنابراین می‌توان چندین اجرا را به‌طور متوالی و بدون مداخله تکمیل کرد.

نمونه های مایع در اختیار انژکتور قرار می گیرند و برای القای تبخیر به محیطی فوق گرم تزریق می شوند. گرمای شدید در کوره داخلی GC حفظ می شود تا از تراکم در لوله GC جلوگیری شود.

پس از عبور از لوله GC، آنالیت ها وارد یک آشکارساز می شوند که سیگنالی را در حضور آنالیت تولید می کند، که برای تجزیه و تحلیل داده ها استفاده می شود. پس از خروج از آشکارساز، فاز متحرک به یک مخزن زباله که اغلب یک ظرف تحت فشار است، می رود.

فاز متحرک مورد استفاده در کروماتوگرافی گازی گازی است. با این حال، گاز مورد استفاده باید توسط سیستم GC غیرقابل شناسایی باشد تا در تولید داده ها اختلال ایجاد نکند.

برای این منظور فازهای متحرک GC یا گازهای حامل کوچک و اغلب بی اثر هستند. اکسیژن اغلب می تواند به فاز ثابت یک ستون GC آسیب برساند، بنابراین هوای معمولی هرگز نباید از دستگاه کروماتوگرافی گازی عبور داده شود.

در حالی که رایج ترین گازهای حامل نیتروژن، هیدروژن و هلیوم هستند، نیتروژن مقرون به صرفه ترین و پایدارترین گازها است که می تواند توسط یک ژنراتور گاز تولید شود و در یک مخزن تحت فشار استاندارد نگهداری شود.

ستون های GC

ستون های کروماتوگرافی گازی یا شیشه ای یا فولادی ضد زنگ هستند و می توانند به دو دسته اصلی تقسیم شوند: ستون های بسته بندی شده و ستون های مویرگی. ستون های بسته بندی شده حاوی کره هایی از ذرات خاک دیاتومه هستند که با فاز ثابت مورد نظر پوشش داده شده اند.

این کره ها در ستون شل هستند. ستون های بسته بندی شده برای جداسازی گاز ثابت و زمانی که غلظت نمونه بسیار بالا باشد استفاده می شود. ستون های مویرگی یک فناوری جدیدتر هستند و با ستون های بسته بندی شده تفاوت دارند زیرا تمام دیواره ستون داخلی در فاز ثابت پوشش داده شده است.

ستون های مویرگی نازک تر و طول بیشتری نسبت به ستون های پر شده دارند. این ستون را قادر می سازد تا غلظت های پایین نمونه را به پیک های تعریف شده جدا کند. اکثر روش‌های GC به دلیل حساسیت برتر و نیاز به نمونه کم، در ستون‌های مویرگی انجام می‌شوند.

فاز ثابت یک ستون GC مسئول عمل نگهدارنده آن است. بر خلاف کروماتوگرافی مایع، فاز متحرک در طول یک برنامه GC هیچ نقشی در شیمی جداسازی ندارد.

در نتیجه، ستون‌های GC دارای طیف گسترده‌ای از فرمول‌های فاز ثابت برای پوشش طیفی از آنالیت‌های احتمالی هستند. این فازها اغلب دارای فرمولاسیون های اختصاصی هستند که حتی تخصص بیشتری را ارائه می دهند، مانند مقاومت در برابر دما یا جداسازی ایده آل برای آشکارسازهای خاص.

لوازم جانبی GC

ستون های GC برای ماندن در شرایط بهینه نیاز به تعویض معمولی قطعات دارند. انتهای ستون که به محل تزریق نمونه متصل می شود، اغلب به دلیل ورود ترکیبات تازه تبخیر شده، می سوزند و آسیب می بینند.

این انتهای ستون‌ها را می‌توان با حفاظ‌های ستون محافظت کرد، اما اصلاح منظم انتهای ستون‌های سوخته با تیغ سرامیکی همچنان باید انجام شود. ستون از طریق لوله ای به نام فرول هم سطح با درگاه تزریق نگه داشته می شود.

فرول ها با گرما و استفاده طولانی مدت فرسوده می شوند و باید هنگام بریده شدن ستون تعویض شوند. محل تزریق همچنین به یک فریت نیاز دارد تا آنالیت ورودی ناخالصی‌ها را فیلتر کند که ممکن است به ستون GC آسیب برساند.

این فریت باید هر چند بار تعویض شود تا از آلودگی متقاطع نمونه ها جلوگیری شود. سرنگ تزریق با استفاده فرسوده می شود و نیاز به تعویض دوره ای سوزن و پیستون آن دارد.

عدم تعویض منظم هر یک از این اجزا می تواند منجر به از دست دادن حساسیت دستگاه GC یا آسیب به ستون GC شود.

سیستم‌های GC همچنین از فیلترهایی برای تصفیه فاز متحرک قبل از ورود به سیستم استفاده می‌کنند و در پایان ضایعات پساب را تمیز می‌کنند.

زباله ها اغلب در ظروف تحت فشار ذخیره می شوند که برای جلوگیری از قرار گرفتن در معرض خطرناک باید از نظر نشتی و نقاط استرس نظارت شوند. سایر لوازم جانبی GC به خوانایی برخی از ترکیبات کمک می کنند.

یکی از این سیستم ها یک واحد دفع حرارتی تحلیلی است که ترکیبات آلی فرار کمیاب را در محدوده قابل خواندن متمرکز می کند.

کروماتوگرافی ستونی

از آنجایی که پروتئین ها دارای ویژگی های متفاوتی مانند اندازه، شکل، بار خالص، فاز ثابت استفاده شده و ظرفیت اتصال هستند، هر یک از این اجزای مشخصه را می توان با استفاده از روش های کروماتوگرافی خالص کرد.

در بین این روش ها، بیشتر کروماتوگرافی ستونی استفاده می شود. این تکنیک برای خالص سازی بیومولکول ها استفاده می شود. بر روی یک ستون (فاز ثابت) ابتدا نمونه ای که قرار است جدا شود، سپس بافر شستشو (فاز متحرک) اعمال می شود .

جریان آنها از طریق مواد داخل ستون قرار داده شده بر روی یک تکیه گاه فایبرگلاس تضمین می شود. نمونه ها در پایین دستگاه به روشی وابسته به tme و حجم جمع می شوند.

کروماتوگرافی تبادل یونی

کروماتوگرافی تبادل یونی بر اساس برهمکنش های الکترواستاتیکی بین گروه های پروتئین باردار و مواد پشتیبان جامد (ماتریس) است.

ماتریس دارای بار یونی مخالف بار پروتئینی است که قرار است جدا شود، و میل پروتئین به ستون با پیوندهای یونی به دست می آید. پروتئین ها یا با تغییر pH، غلظت نمک های یونی یا قدرت یونی محلول بافر از ستون جدا می شوند .

ماتریس های تبادل یونی با بار مثبت، ماتریس های تبادل آنیون نامیده می شوند و پروتئین های دارای بار منفی را جذب می کنند. در حالی که ماتریس های متصل به گروه های دارای بار منفی به عنوان ماتریس های تبادل کاتیونی شناخته می شوند و پروتئین های دارای بار مثبت را جذب می کنند.

کروماتوگرافی با نفوذ ژل (الک مولکولی).

اصل اساسی این روش استفاده از مواد حاوی دکستران برای جداسازی ماکرومولکول ها بر اساس تفاوت آنها در اندازه های مولکولی است. این روش اساساً برای تعیین وزن مولکولی پروتئین ها و کاهش غلظت نمک محلول های پروتئین استفاده می شود .

در یک ستون نفوذ ژل، فاز ساکن از مولکول های بی اثر با منافذ کوچک تشکیل شده است. محلول حاوی مولکول هایی با ابعاد مختلف به طور مداوم با سرعت جریان ثابت از ستون عبور می کند.

مولکول های بزرگتر از منافذ نمی توانند در ذرات ژل نفوذ کنند و بین ذرات در یک منطقه محدود باقی می مانند. مولکول های بزرگتر از فضاهای بین ذرات متخلخل عبور می کنند و به سرعت در داخل ستون حرکت می کنند.

مولکول‌های کوچک‌تر از منافذ در منافذ پخش می‌شوند و با کوچک‌تر شدن مولکول‌ها، ستون را با زمان‌های ماندگاری نسبتاً طولانی‌تری ترک می‌کنند .

نوع Sephadeks G پرکاربردترین مواد ستون است. علاوه بر این، دکستران، آگوروز، پلی آکریل آمید نیز به عنوان مواد ستون استفاده می شود.

کروماتوگرافی میل ترکیبی

این تکنیک کروماتوگرافی برای خالص سازی آنزیم ها، هورمون ها، آنتی بادی ها، اسیدهای نوکلئیک و پروتئین های خاص استفاده می شود .

لیگاندی که می تواند با پروتئین خاص (دکستران، پلی آکریل آمید، سلولز و غیره) کمپلکس بسازد، مواد پرکننده ستون را متصل می کند. پروتئین خاصی که با لیگاند کمپلکس می کند به تکیه گاه جامد (ماتریکس) متصل می شود و در ستون باقی می ماند، در حالی که پروتئین های آزاد ستون را ترک می کنند.

سپس پروتئین متصل شده با تغییر قدرت یونی خود از طریق تغییر pH یا افزودن محلول نمک از ستون خارج می شود.

کروماتوگرافی کاغذی

در کروماتوگرافی کاغذی مواد پشتیبان از یک لایه سلولز بسیار اشباع از آب تشکیل شده است. در این روش یک کاغذ صافی ضخیم تکیه گاه را تشکیل می داد و قطرات آب در منافذ آن نشست می کرد و «فاز مایع» ساکن را تشکیل می داد.

فاز متحرک شامل یک سیال مناسب است که در یک مخزن در حال توسعه قرار می گیرد. کروماتوگرافی کاغذی یک کروماتوگرافی مایع – مایع است.

کروماتوگرافی لایه نازک

کروماتوگرافی لایه نازک یک کروماتوگرافی “جذب جامد- مایع” است. در این روش فاز ثابت یک ماده جاذب جامد است که روی صفحات شیشه ای پوشانده می شود.

به عنوان ماده جاذب از تمام مواد جامد استفاده می شود. در کروماتوگرافی ستونی (آلومینا، سیلیکاژل، سلولز) می توان استفاده کرد.

در این روش، فاز متحرک از طریق فاز ساکن به سمت بالا حرکت می کند. حلال با استفاده از عمل مویرگی از صفحه نازک آغشته به حلال به سمت بالا حرکت می کند.

در طی این روش، همچنین مخلوطی را که قبلاً روی قسمت‌های پایینی صفحه ریخته شده است، با پیپت به سمت بالا با سرعت‌های جریان متفاوت هدایت می‌کند. بنابراین جداسازی آنالیت ها حاصل می شود. این سرعت حرکت رو به بالا به قطبیت ماده، فاز جامد و حلال بستگی دارد.

در مواردی که مولکول‌های نمونه بی‌رنگ هستند، می‌توان از فلورسانس، رادیواکتیویته یا یک ماده شیمیایی خاص برای تولید یک محصول واکنش‌پذیر رنگی مرئی استفاده کرد تا موقعیت آنها در کروماتوگرام مشخص شود.

تشکیل یک رنگ قابل مشاهده را می توان در زیر نور اتاق یا نور UV مشاهده کرد. موقعیت هر مولکول در مخلوط را می توان با محاسبه نسبت بین مسافت طی شده توسط مولکول و حلال اندازه گیری کرد.

این مقدار اندازه گیری تحرک نسبی نامیده می شود و با نماد Rf بیان می شود. RF. مقدار برای توصیف کیفی مولکول ها استفاده می شود .

کروماتوگرافی لیگاند رنگی

توسعه این تکنیک مبتنی بر نشان دادن توانایی بسیاری از آنزیم ها برای اتصال نوکلئوتیدهای پورین برای رنگ Cibacron Blue F3GA بود . ساختار حلقه مسطح با گروه های بار منفی مشابه ساختار NAD است. این تشابه با نشان دادن اتصال رنگ Cibacron Blue F3GA به آدنین، محل های اتصال ریبوز NAD اثبات شده است.

رنگ به عنوان آنالوگ ADP-ribose رفتار می کند. ظرفیت اتصال این نوع جاذب ها 10 تا 20 برابر قوی تر از میل ترکیبی جاذب های دیگر است. تحت شرایط pH مناسب، شستشو با محلول های با قدرت یونی بالا و با استفاده از خاصیت تبادل یونی جاذب، پروتئین های جذب شده از ستون جدا می شوند.

کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفوبیک

در این روش از جاذب های تهیه شده به عنوان مواد ستونی برای اتصال لیگاند در کروماتوگرافی میل ترکیبی استفاده می شود. تکنیک HIC مبتنی بر برهمکنش های آبگریز بین زنجیره های جانبی متصل به ماتریس کروماتوگرافی است.

کروماتوگرافی شبه میل ترکیبی

برخی از ترکیبات به‌عنوان رنگ‌های آنتراکینون و آزو رنگ‌ها می‌توانند به‌عنوان لیگاند به‌عنوان لیگاند استفاده شوند، به‌ویژه برای دهیدروژنازها، کینازها، ترانسفرازها و ردوکتازها.

نتیجه

در ابتدا از تکنیک های کروماتوگرافی برای جداسازی مواد بر اساس رنگ آنها استفاده می شد، همانطور که در مورد رنگدانه های گیاهی وجود داشت. با گذشت زمان، حوزه کاربرد آن به طور قابل توجهی گسترش یافت. امروزه کروماتوگرافی به عنوان یک روش جداسازی بسیار حساس و موثر پذیرفته شده است.

کروماتوگرافی ستونی یکی از روش های مفید جداسازی و تعیین است. کروماتوگرافی ستونی یک روش خالص سازی پروتئین است که به ویژه بر اساس یکی از ویژگی های مشخصه پروتئین ها محقق می شود.

علاوه بر این، از این روش ها برای کنترل خلوص پروتئین استفاده می شود. تکنیک HPLC که دارای ویژگی‌های برتر از جمله حساسیت بالاتر، سرعت گردش سریع، استفاده از آن به عنوان یک روش کمی است، می‌تواند اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربن‌ها، کربوهیدرات‌ها، داروها، آنتی‌بیوتیک‌ها و استروئیدها را تصفیه کند.